答疑 | 3D细胞培养及类器官模型研究应用线上讲座——留言问题解答篇（一）
讲座回顾
8月26日19：00-21：00，由Promega和科途联合举办的3D细胞培养及类器官模型研究应用线上讲座已经圆满收官。
讲座受到了广大参会者的一致好评。很多参会者积极提问，但是由于会议时间有限，嘉宾未来得及一一解答。因此我们在会后整理出了所有留言，现将部分问题和回答公布如下，其余的问题后续也将陆续发布，敬请期待哦！
01 瘤类器官的培养中，是否也可以加入一些体内其他的细胞？比如: 上皮，内皮细胞等。如果加入这类细胞，会不会能更好的模拟肿瘤在体内的状况？
答：细胞和内皮细胞与类器官培养条件不同，可以尝试微流体技术分隔培养。
02 类器官的培养基需要自己设计，还是说有成品方案？自己设计一般怎么设计？
答：需要自己设计，不同类器官需要的培养因子稍有不同。推荐北京科途医学科技有限公司商品化的培养基。如果是自己设计，主要根据不同niche factor 组合来设计培养基。
03 3D培养类器官后，消化成细胞，可以检测细胞迁移能力吗？
答：消化成单细胞检测细胞迁移意义不大，类器官是一个细胞整体。推荐使用类器官侵袭实验来代替迁移实验检测肿瘤的invasion能力。
04 类器官的培养是否需要在suspension culture plate？可以用96孔板培养肺癌类器官吗？
答：膀胱癌类器官是可以悬浮培养的。类器官培养一般推荐使用24孔板。
05 类器官体内移植，是在培养多少天移植，会不会堵塞针头？
答：在类器官前几代状态比较好的时候进行体内移植。类器官消化成细胞簇后不会堵塞针头。
06
1）Organoid传代消化时间？
2）Biobanker冻存时是类似传代消化后直接加冻存液即可吗？
3）药物浓度是如何筛选和设置的呢？是根据IC50吗？
4）除空泡状形态外，有没有出现实心状的Organoid？
答：
1）不同类器官传代消化时间不同，大约控制在5分钟左右。
2）可以在消化传代后用Biobanker直接冻存。
3）药物浓度和选择参考
http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.03.053这篇文章。
4）类器官有实心状态的，类器官形态和其亲本肿瘤组织形态有关，例如低分化肿瘤组织会出现实心状类器官。
07 不同药物敏感性检测时如何选择药物浓度？联合用药是怎么确定两种药物浓度的？
答：药物浓度和选择参考http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.03.053这篇文章。联合用药浓度需要选择多个dose，从药物抑制最高浓度稀释7个dose左右，两两组合。
08 organoid harvest solution是商品化成品吗？另外慢病毒转染organoid 是否需要harvest solution 预处理BME呢？
答：organoid harvest solution是商品化的。慢病毒转染organoid需要harvest solution 预处理，将类器官从BME中释放出来再消化成单细胞。
09 类器官建立的成功率在多少，是否能维持长期培养？
答：不同癌症培养成功率不同，肠癌大概70%左右。肿瘤类器官可以进行长期培养。
10 类器官培养最大的壁垒是什么？类器官培养目前最大的缺陷是什么？
答：壁垒是患者肿瘤组织本身就具有很大异质性，造成每株类器官培养因子，生长速度，分离培养难易程度都不同。
缺陷是类器官体系中没有免疫细胞和血管内皮细胞。
11 请问类器官可以使用自噬检测方法吗？
答：需要测试。首先自噬检测方法需要对细胞做改造，要通过外源表达（转染报告基因载体）或者CRISPR技术给LC3蛋白N端加上HiBiT标签。其次，试剂对类器官的裂解效果需要使用者自己验证，验证方法可以是用CTG 3D和检测试剂Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System分别检测后看两种方法的相关性，如果相关性好，说明在这个模型可行。https://www.promega.com.cn/Resources/PubHub/2019/verifying-cell-based-assays-for-use-with-3d-models/
12 直播中主要介绍结合酶标仪的检测方案，是否有结合活细胞分析系统的应用案例呢？
答：RealTime-GloTM MT Cell Viability Assay，CellToxTM Green Cytotoxicity Assay，RealTime-GloTM Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay，这几种方法都是可以实现活细胞实时监测的，如果活细胞工作站有发光和荧光检测模块，应当可以使用这几种方法监测细胞活力、毒性或凋亡。
以上回答仅供参考！
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