类器官药物高通量筛选

Date:

2023年9月15日

Category:

科途医学已建立类器官药物高通量筛选服务体系

技术服务内容：

  • 类器官模型扩增和样品制备
  • 类器官模型天然药物化合物库高通量筛选技术服务
  • 类器官模型FDA获批药物库高通量筛选技术服务

科途医学类器官药物高通量筛选技术服务为新药研发企业及各大科研院所提供相关的研发技术服务。

高通量筛选 (High throughput screening, HTS ) 技术，是指以分子水平和细胞水平的实验检测方法(assay)为基础，以微孔板形式作为载具，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机分析处理实验数据，在同一时间检测成千上万的样品，并以得到的相应数据库支持运转的技术体系，它具有微量、快速、灵敏和准确等特点。HTS是发现创新药物的重要技术手段之一，在新药研发和基础研究得到广泛应用。

图1. 结合微孔板和自动化系统的高通量药物筛选（科途医学实验照片）
一、患者来源的类器官模型

患者来源类器官 (Patient-derived organoids, PDOs) 是疾病模型的突破性新技术。其中，患者来源的肿瘤类器官保留了原始肿瘤组织的形态学、遗传学特性和典型生物标志物表达、异质性等特征，在此基础上还可稳定传代，因此在体外靶点筛选和药物响应评估方面具有得天独厚的优势。研究表明，PDOs对靶向药和化疗药的响应情况与患者高度匹配[1,2]，表明其可精准预测药物疗效，是新药筛选、个性化用药和精准医疗的理想模型。筛选适配HTS的PDO模型，需要确认其具有较好的增殖稳定性，还需要对类器官进行遗传特征进行确认（使用测序，fish等方法），确保其遗传特征符合预期，此外还需要对其疾病特征的代表性进行鉴定（图2）。

图2. 用于HTS的类器官模型构建和鉴定
二、适配高通量筛选的类器官实验检测方法建立

适配高通量筛选的类器官实验检测方法，需要具有非常高的灵敏性和鲁棒性。我们采用Promega公司出品的CellTiter-Glo® 3D细胞活力测试法评价类器官细胞活力。该测试通过定量代谢活跃的细胞内ATP含量，实现对PDOs培养物中活细胞的定量 (图3)。类器官模型被复苏后，需要经过扩增，以满足HTS所需要的细胞量，通常需要1.2-1.5×107细胞/千化合物，约12-15块96孔板/千化合物。完成扩增后，类器官被传代，铺板，培养48小时后，加入化合物文库。类器官继续培养5-7天后，加入CellTiter-Glo® 3D裂解液，震荡10分钟，检测化学发光（图3）。

图3. 类器官HTS实验检测方法建立

为了对HTS进行质控，利用DMSO (0.1% v/v) 处理组作为阴性对照，1μM星孢菌素或2.5μM Dactolisib (BEZ235)作为阳性对照，以计算HTS方法的Z因子（Z factor）和信号窗口（signal window），Z因子计算公式为: 1 – ( 3 * (σp + σn) / |(μp – μn)| ))。Z因子被用来评估实验检测方法质量。Z因子落在0.5-1区间范围内则判定测试方法满足要求(图2C、D)。

三、HTS适配化合物文库

多种类型的化合物文库，可以适配类器官的高通量筛选。包括天然产物化合物库（包含1000-4000个天然化合物）、FDA获批药物库（包含2000-3000个获批药物）、老药新用化合物库（包含约4000个化合物）和代谢化合物库（包含约800-5000个化合物）等。也可筛选订制文库（图4）。

图4. 一个化合物文库
四、高通量筛选的数据分析

推荐使用Tibco Spotfire和R用于HTS数据可视化和分析。Spotfire和R可以高效且可视化的对大量数据进行分析（图5）。

图5. Spotfire分析化合物的界面（来自Spotfire）
应用具体案例：
案例一：三阴性乳腺癌类器官中开展高通量筛选

三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer, TNBC) 是最难治的一个亚类，治疗方案少，且预后差。为此，我们建立了15株TNBC PDOs，形态学分析表明源于不同病人和同一病人不同区域肿瘤组织的类器官存在明显异质性(图6A-D)。从中选取了其中生长迅速的Pt-016号PDO对库里2470个化合物 (药物浓度均为1 μM) 进行了筛选。结果表明，与DMSO对照相比，23个化合物展现了对该PDO 50%的活性抑制 (图6E)。

图6. (A-D) TNBC PDOs典型明场照片；(E) 基于TNBC PDO的HTS结果

随后，我们又选取了一些典型化合物在其余十株TNBC PDOs中进行了第二轮测试，以验证第一轮测试结果，提高准确性 (图7)。

图7.更多TNBC PDOs对典型化合物的响应情况

综上所述，TNBC PDOs保留了原始肿瘤组织的大部分特性，是理想的用于药物HTS的疾病特异性模型。

案例二：TFE融合性肾癌类器官中开展高通量药物筛选

肾癌 (Renal cell carcinoma, RCC)中，有一种好发于青年人、恶性程度极高的亚型，该亚型中存在染色质重排现象，具体为小眼转录因子 (micropthalmia transcription factor, MiT) 家族中TFE3转录因子或TFEC蛋白所在基因 (Xp11.2或11q12基因) 易位 (图9A)。我们从超过50例年轻患者的手术样本中取材，构建了Xp11.2易位RCC (RCC Xp11.2) PDO模型，通过NGS测序验证了其基因易位情况，并通过fish检测验证其突变特征，用HE验证类器官的组织学特征 (图8)。

模型鉴定后，我们建立了Z factor大于0.5的检测方法。在一个5天的药物处理时间的检测中，药物处理的窗口在6倍左右，Z因子大部分可以大于0.5（图9）

图8. (A) 基因易位RCC的典型核型；(B) RCC Xp11.2 PDO的代表性明场 (上) 和HE染色 (下) 图片。

图9. 融合性肾癌检测方法建立和评价

利用该融合性肾癌类器官模型中建立的HTS assay，我们开展了FDA批准的药物文库的筛选，在1 μM药物处理条件下，获得了潜在有效药物 (图10)，并开展药物的进一步验证和机制研究[3]。

图10. RCC Xp11.2 类器官中筛选FDA获批化合物文库

参考文献

[1] G. Vlachogiannis, S. Hedayat, A. Vatsiou, Y. Jamin, J. Fernández-Mateos, K. Khan, et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science 2018, 359, 920-926.

[2] H. Tiriac, P. Belleau, D. D. Engle, D. Plenker, A. Deschênes, T. D. D. Somerville, et al. Organoid profiling identifies common responders   to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discov. 2018, 8, 1112-1129.

[3] Cao C, Lan X, Shang B, Jiang W, Guo L, Zheng S, et al. Phenotypical screening on metastatic PRCC-TFE3 fusion translocation renal cell carcinoma organoids reveals potential therapeutic agents. Clin Transl Oncol. 2022;24(7):1333–46. doi: 10.1007/s12094-021-02774-8.

[4] Li H, Zhang Y, Lan X, Yu J, Yang C, Sun Z, Kang P, Han Y, Yu D. Halofuginone sensitizes lung cancer organoids to cisplatin via suppressing PI3K/AKT and MAPK signaling pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2021;9:773048. doi: 10.3389/fcell.2021.773048.

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