科途公开课：类器官技术文章精选|类器官研究进展与潜力
类器官研究进展与潜力
在过去的几十年里，发育生物学家与干细胞生物学家进行了大量研究，探讨如何控制干细胞沿特定方向进行自我更新与分化。再生医学研究证明：游离干细胞可分化成一种或数种成熟细胞，用来修复损伤器官。这些进展使科学家们有了这样的设想：在体外应用干细胞进行组织重建。实际上，过去数十年中，利用类器官进行组织与器官生物学研究已经取得了突破性进展。类器官的历史最早可以追溯到19世纪70年代，Howard Green 及其同事利用人类原代角质细胞与3T3成纤维细胞共培养，形成类似人类表皮的分层鳞状上皮结构并伴有基质层细胞增殖与上层细胞角质化。但是培养是在二维平面上进行，与在体组织/器官的三维结构仍存在差异。
随着对细胞外基质(ECM)生物学的深入研究与悬浮细胞培养方法的改进，科学家们建立了3D培养系统，为类器官的建立起到了关键作用。Mina Bissell研究组在富含层粘连蛋白基质中培养的3D乳腺类器官被公认为类器官的开篇之作，培养的极性上皮结构围成的腺管样结构可完成分泌功能。在类器官形成过程中，上皮细胞与基底膜之间的相互作用至关重要。真正开创类器官领域的突破性工程要属Yoshiki Sasai和Hans Clevers两个小组。Clevers和他的同事从结肠成体干细胞(ASCs)培养出结肠类器官，Sasai和他的同事则利用多能干细胞(PSCs)培养出皮质和视杯类器官。他们的工作证明干细胞在体外可以自我发育组装成类似体内器官的三维结构，这也成为了“类器官”的基本特征之一。继这些开创性研究之后，其他科学家成功地从不同物种不同来源细胞中成功培养了各种类器官。
“类器官”一词被用于描述各种体外培养物，从组织移植物到器官芯片系统。然而，这种宽泛的界定容易导致混淆。本篇综述中，我们将“类器官”定义为：由干细胞或器官特异性祖细胞在体外发育成具有复杂三维结构、展现类似体内器官结构和功能的细胞团。在这里，我们主要概述类器官分类、生长，及其在基础生物学、疾病建模及再生医学领域内的应用。我们着眼于该领域面临的一些关键挑战，展望如何利用多学科方法构建下一代类器官平台等。组织工程学这个经典的研究领域设计并制造了作为细胞生长骨架的生物相容性材料，研究者利用一系列技术手段来增强组织再生能力，提高类器官培养水平。我们将为读者详解近期关于类器官的一些重要视角。
一· 类器官的生成
类器官生成过程其实就是一群同质细胞的“自器官化”。“自器官化”是细胞自身的一种能力，在“自治”机制引导下，最初是无序的空间排布。随后，这种“自器官化”表现为一系列的“自身构建”事件与形态重排。“自身构建”其实就是在“自治”机制和胞间通讯作用下，同质细胞群完成分化的一个过程。在一系列不同机制相互作用下(包括应答扩散机制、调控网络双稳性、不对称性细胞分裂)，细胞打破初始的对称性，不同细胞开始分群，进行结构重排。这是一种系统性高层次的重建，不同类细胞通过相互间物理作用(包括粘附、外层张力、收缩、运动)进行分群，分群后的细胞通过形态变化、收缩、运动或不同组织扩增等进行结构重排。这种重排是由系统 “自治”机制所控制的，类器官的建立就是在体外重现这个过程。因此，要想成功培养类器官，需要注意以下三点： 1，培养环境的物理特性；2，内源性和/或外源性信号；3，初始细胞类型及体系环境。以上三点会影响最终生成的类器官特征。
培养环境的物理特性
胞外基质(ECMs)是类器官形成 3D 结构的最主要因素，它不仅为细胞生长提供营养，还可以为细胞粘附提供介质。基质凝胶是从 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤中提取、 纯化出的一种天然胞外基质，是目前应用最广泛的类器官培养基，利用基质凝胶或类似的动物来源的水凝胶，已成功培养出了包括肠、脑、胃及乳腺等组织的类器官。也有一些实验室利用 I 型胶原基质做为培养基进行乳腺、肠道类器官培养。这些天然基质的主要优点是既有细胞外基质成分又可提供生长因子，可以使类器官细胞在其中生长分化。然而，基质成分的复杂性与多样性也使培养环境难以实现标准化并难以重复。 近期，一种已知化学成分的水凝胶代替天然基质物被用来进行肠和脑类器官的培养， 使培养基的生化条件与培养机制易于控制，但其本身生物活性较低，需要根据不同类器官的培养要求进行配置。
对于视杯、大脑、小脑及海马体的类器官培养，则采用悬浮培养方式。这种液态培养基方法无法为细胞生长提供立体支撑结构，有时可加入低浓度基质凝胶，便于上皮细胞极化。
肾脏类器官使用气-液界面法培养：细胞团块种植在薄的微孔膜上，细胞培养基只接触膜的底部。细胞团块“自器官化”成类似于原肾的多层结构。
截至目前为止，类器官的培养条件都基本基于经验选择，缺乏对不同实验方案的系统性比对，每个方案的优缺点及其具体应用还无法明确。
内源性和外源性信号
类器官细胞在特定时间点受形态发生素刺激，激活特定生长信号通路，这些信号可以触发“自器官化”过程，但只有当系统中所有必要成分都存在时“自器官化”才能完成，当某种成分缺乏时，需要外源补给才能完成此过程。
某些类器官的生长完全依赖于内源性信号。如由小鼠多能干细胞(PSCs)培养的视杯类器官，首先在低浓度生长因子的无血清培养基中形成统一的神经上皮细胞(NE)，然后，通过“自我构建”机制，形成空间分布不同的神经视网膜(NR)团与视网膜色素上皮细胞(RPE)团 ，最后，完成形态发生过程。整个过程都是在无外部生物信号下进行的。 因此，初始细胞群在一开始就具备了“自器官化”所需的所有组分并遵循其默认的发育轨迹生长为类器官。然而，即使没有人为添加，基质凝胶中也可能存在少量外源组分。
多数类器官培养过程中需要提供外源组分，因为初始细胞一般不可能已具备“自器官化”所需的所有组分。而某些类器官的培养只在初始阶段需要外源信号分子的刺激，之后，完全依赖系统“自治”信号即可完成“自器官化”过程。例如，人源多能干细胞(hPSCs)在形成输尿管上皮细胞和后肾间充质细胞过程中，需依赖特定的外源性生长因子刺激，之后，不再需要添加生长因子即可形成肾脏类器官。
对其他类器官而言，整个生成过程中都需要适量特定的外源信号刺激。如人多能干细胞(hPSCs)来源的胃类器官的生长过程需要添加外源性生长因子促进其内胚层向成熟的前肠组织发育，其后，仍然需要外源性生长因子刺激向胃窦部或底部上皮方向分化、生长、形态形成。
虽然所有的类器官培养都需要生长因子刺激，但由多能干细胞诱导的类器官尤其需要特殊生长因子的定期刺激，以保障体系在正常的轨迹下发育。基于我们目前对机体发育机制的了解来决定何时添加何种生长因子。
初始细胞类型和原始生长环境
细胞初始状态不同，诱导其生成不同类器官的实验流程也不同；初始培养环境不同，细胞的“自器官化”过程也不同。当类器官来自单个细胞类型时(如视杯、小肠类器官)，类器官的生成首先是细胞打破初始的对称性，然后不同细胞开始分群，进行结构重排，再经过形态发育，最后发育成类器官结构。当类器官起始于单个细胞时，则需要先进行细胞扩增，再进入“自器官化”过程。另一种类器官，如 PCS 来源的肝脏类器官，其细胞已经经过分化，因此直接进入细胞分类、结构重排过程(图一)。细胞团的初始状态也会影响类器官作为生物学模型的应用：那些使用祖细胞并且依靠祖细胞自发分化完成“自器官化”的类器官比那些直接将分化好的细胞混合培养形成的类器官更接近在体器官发育状况。
类器官的特征也取决于初始细胞的类型。类器官可以来源于 ASCs(作为分离细胞或从组织碎片获取)、PSCs 或胎儿干细胞。某些类器官仅来源于 PSCs，如神经外胚层类器官(如视杯和脑类器官)以及中胚层肾类器官等；外胚层类器官(尤其是腺组织)主要来源于 ASCs 或成人游离组织；大多数内胚层的类器官来源于 PSCs 和 ASCs。近来， 终分化细胞被重新加工成为类似 ASC 的组织特异性细胞，用来进行上皮性乳腺和胰腺类器官的培养。少数研究者利用胚胎干细胞进行类器官的培养，分别是从小鼠胚胎(胚胎第 10.5 天)背侧胰腺分离的细胞中获得细胞，另外一项研究是从分离的人类胎儿肠组织中获得细胞进行类器官培养。
因为不同类型细胞来自不同的发育阶段，其遵循不同的发育途径；因此，初始细胞的选择尤为重要。来自 ASCs 或成人组织碎片的类器官被认为可以模拟其在体状况或再生条件。因此，如果干细胞来自于某些器官，这些器官在在体情况下不断自我更新，如小肠、结肠或胃的上皮细胞，那么由这些干细胞形成的类器官也可以模拟在体器官的生理过程。如果细胞来源于那些自我更新很慢、只有在组织损伤时干细胞才发挥作用的器官如胰腺、肝脏等器官，则这类类器官更适合于进行再生医学应用。虽然这两种情形在在体情况下很好区分，但在体外培养条件下却很难界定。例如，有报道称，肠道类器官的形成机制就不同于在体状况，而是在某些再生刺激条件下被激活的。同样， 胃类器官的细胞起源于在体内受损伤后增生的初始细胞。
ASC 来源的类器官通常用来研究有关成人组织生物学的问题，PSC 来源的类器官主要用于研究器官生成与组织发育。PSC 来源的类器官很少在体外达到成体组织成熟度， 通常与胎儿组织类似。导致 PSC 来源的类器官成熟受限的一个可能原因是，实验室实际培养时间往往达不到细胞完全成熟所需时间。另一种可能的原因是，在体外培养PSC 时，我们无法提供胚胎发育过程中所需的所有要素，PSC 无法和其他细胞发生相互作用。
一种被称为“胚胎类器官”的系统可以用来建立更好的体外发育模型。这些 PSC来源的类器官也称为“胚状体”或“胚囊”，可以模拟着床前及着床后早期胚胎发育、 体轴形成、原肠胚形成和神经管发育。然而典型的类器官通常由来自一个胚层的同类细胞，但胚胎类器官来自多个胚层的细胞，像真实胚胎一样。胚胎类器官具有高度复杂性，可以用来研究不同类型细胞在发育过程中的相互作用。
胚胎干细胞来源的类器官其细胞直接从胎儿组织取得，细胞介于 ASCs 和 PSCs 之间，因此，可用于研究比 PSC 来源的类器官更成熟阶段的器官形成机制。例如，利用来自胎儿肠干细胞的肠囊研究人肠道类器官的成熟过程。
二· 类器官的应用
在发育学、内环境稳态研究和再生医学中的应用
类器官可以在体外重现器官生物学机制，而且类器官做为一种简单、可操作性强的“迷你器官”模型，可以用来研究不同组织成分在形态形成过程中各自发挥的作用。 利用类器官为模型，已经揭示了在稳态、再生和发育等过程中组织的“自器官化”机制。这些机制的研究在在体情况下很难开展。例如，在 ASC 来源的肠道类器官中，从隐窝中分离得到的干细胞在没有间叶细胞的情况下形成肠上皮，在 PSC 来源的视杯类器官中，视神经泡在无外胚层信号刺激下自行发育成形。
类器官的一个重要特征是可操作性强，是研究器官形成过程与器官生物学的利器。Lgr5+小鼠肠道干细胞(ISCs)的自我更新依赖于相邻的潘氏(Paneth)细胞，Paneth 细胞表达高水平的 WNT 配体，而 WNT 信号对 ISC 非常重要。一项设计巧妙的研究利用肠道类器官模型，用带有标记的 WNT 亚型的细胞来深入研究 WNT 在肠道生物学中的作用。研究结果表明：WNT 不是通过扩散发挥作用，而是从 Paneth 细胞转移到邻近的 ISC，WNT 的浓度随着 ISC 的分裂被逐渐稀释。以上结果表明 Paneth 细胞作为 ISC 自我更新所需 WNT 信号的来源，它在隐窝中的分布决定了 ISC 是自我更新还是分化。这一结果进一步阐明了之前在在体克隆分析实验中得到的结论，即 Paneth 细胞竞争性抢占隐窝位置决定了 ISCs 是自我更新还是分化。
通过视杯类器官模型也揭示了视杯形成机制：视网膜色素上皮细胞(RPE)中神经视网膜(NR)膜内陷过程。在从视泡向视杯转化的不同阶段，分别用抑制细胞骨架收缩和抑制细胞增殖的药物处理类器官模型，可以看出视杯形成是一个多阶段过程：细胞骨架重组引起特异性区域改变，进而使囊泡内陷，NR 的收缩性和刚性降低，而 RPE 的收缩性和刚性维持。随后，细胞增殖成为 NR 内陷的主要推力。
人体组织的不易获得性及伦理问题限制了对人类发育学、器官生物学的研究，而类器官模型将提供这一便利，而且还为研究人与其他物种之间的发育相似性或差异性提供条件。例如连环素(β-catenin)基因是编码 WNT 通路的核心转录因子, 如果小鼠胚胎缺乏此基因，则会发生胃底缺乏及胃窦扩大，表明 WNT 信号在胃底形成发挥重要作用。为了确认 WNT 信号通路在人类胃发育中的作用，利用 WNT 抑制剂作用于前肠后段 PSC 来源的胃类器官，并通过对区域特异性标记物的表达分析观察胃窦到胃底的转变。
通过胃类器官模型，可以揭示人与小鼠间的共同发育机制，而视杯类器官则揭示了人类特有的发育特征，而且人类视杯类器官所需发育时间较小鼠视杯类器官要长，体积更大，视网膜也更厚。人类与小鼠胚胎组织分析也证实了这些种特异性差异。此外，视杯类器官还揭示了物种特有的形态发生机制。正常情况下，在从视泡到视杯的形成过程中，NR 由顶凹结构变为顶凸结构，这种“外翻”需要 NR 与 RPE 有连续性才能完成，如果在囊泡阶段把 NR 从 RPE 分离出来，则 NR 不会完成外翻。而如果在囊泡阶段把人的 NR 从 RPE 分离出来，NR 仍然能够通过整合素介导而不需要肌球蛋白完成外翻。
类器官做为一种方便的“迷你”系统，可以用来研究“自器官化”的机制。有一项胚囊类器官研究发现细胞在成形素作用下自主完成了空间形态塑造。在这些研究中， 通过实验数据与电脑模拟结合，可以探究“自器官化”的特定分子机制，还可以观察胚囊类器官在不同初始培养状态下的行为学。数学模型在阐明自器官化机制、预测不同条件对结果的影响等方面非常有帮助，增强了我们在体外情境下控制复杂多细胞生物行为的能力。
在疾病建模、新药发现与个体化医疗中的应用
与传统细胞培养相比，类器官的明显优势就是能够在器官级别模拟疾病病理过程。此外，还可以再现重要的人类疾病特征。目前已建立了多种疾病的类器官模型如遗传病、 病原体感染性疾病、癌症等。将幽门螺杆菌注射入人体胃类器官可以复制幽门螺杆菌感染的典型特征。因为种属特异性，动物模型不适合研究人类胃的病理，而且小鼠体感染幽门螺杆菌后并不会像人类那样发展成溃疡与胃癌。
类器官可以模拟人体发病机理，使类器官平台成为药物检测与筛选的优质平台。 例如，最近在人 PSC 来源的皮层神经干细胞中筛选了治疗寨卡病毒感染的药物，并在类器官和小鼠模型中进行了平行验证，证实类器官可用于检测药物。在囊性纤维化(CF，CFTR 基因，囊性纤维跨膜转导调控因子缺陷引起的一种遗传性疾病)药物测试中使用类器官也取得了开创性的结果。携带 CFTR 突变的患者来源的肠道类器官可能是目前为止唯一应用于个体化医疗的案例。一位罕见 CFTR 突变患者的类器官经过药物筛选并将有效药物应用于患者，使患者获得了临床获益。药物筛选以 cAMP 诱导的类器官肿大做为 CFTR 功能恢复的标志，并对小鼠和患者来源的肠道类器官进行了优化，得到了至少五种不同突变类型的类器官模型。另一个里程碑是建立了类器官高通量筛选，如近期利用肾脏类器官进行药物筛选。
类器官的另一个重要应用是建立不同疾病类型类器官生物库。即基于各种遗传变异建立强大的筛选平台，如建立覆盖主要 CFTR 突变类型的囊性纤维化肠道类器官库。 建立癌症类器官生物库意义更为重大，因为癌症几乎包含无限量的基因突变。已经有很多探索建立肿瘤类器官的研究，最初的尝试是建立人结肠癌类器官生物库，一项研究从 20 名患者中建立了原发结肠癌类器官，这些类器官很好地保留了原发肿瘤组织的病理学与遗传特性。另一项研究结果显示：对不同突变类型类器官的药物筛选结果与临床用药结果相符。还有研究者建立了 55 种不同组织学分型与分期的结直肠癌类器官。 胃肠道癌症类器官也被应用进行药物筛选以指导临床用药; 此外，还有一个由 22 种不同组织病理学与分子学特征的人源膀胱癌类器官组成的库已建立成功。
从患者来源的 iPSCs 中生成的类器官还可以被用来研究基因背景不明的疾病尤其是具有患者间高变异性的复杂病症。最近在脑类器官的研究对自闭症发病机制进行了探究，结果显示，FOXG1 过表达导致的 GABAergic 神经元过剩可能是发病机制之一。
类器官平台的建立可以大大减少实验动物的使用量。
再生医学
在再生医学领域，类器官也有广泛应用。源于小鼠胚胎干细胞(ESCs)或小鼠 iPSCs的视网膜类器官被移植入视网膜受损的小鼠中，可以产生成熟的光感受器，有的还可以与宿主细胞建立突触连接，恢复光感。人类胚胎干细胞来源的视网膜类器官移植到视网膜受损大鼠和灵长类动物模型时，也能存活成熟，并与宿主组织产生一定程度的融合。从游离的小鼠结肠上皮细胞或单个干细胞中培养并移植到小鼠体内的肠道类器官，能够不同程度地修复结肠黏膜损伤。同样，从胚胎肠干细胞中生长的移植型肠细胞团也可以整合到受伤的小鼠结肠中并在体内进行分化。动物模型的移植实验也有关于肝和肾类器官移植的报道。事实上，与缺乏合适生理环境的细胞移植相比，类器官有能力进行器官重建并有可能供保护移植物不受有害环境影响，这在细胞治疗应用方面优势明显：研究证实，3D 结构的移植物比游离的胚胎视网膜干细胞能更好地与宿 主小鼠视网膜结合。
将类器官技术与基因编辑加工技术联合应用进行自体同源移植，可用于治疗基因缺陷疾病：一项研究使用 CRISPR–Cas9 基因编辑方法对类器官进行加工，生成功能性类器官，用以移植治疗 CFTR 突变。
尽管只是一些初步结果，但可以看出，类器官的临床移植应用具有极大的可行性。
三· 向新一代类器官前行
类器官与原器官在结构与功能上的相似度决定了其在发育、再生等领域的应用。尽管类器官领域发展迅速，但未来几十年我们的任务仍然是尽可能地缩短类器官与天然器官之间的差距。类器官之间存在表型多样性。可重复性是有待解决的一大问题，在药物筛选中，类器官模型之间的高度多样性会使药效难以判读。而且不同类型的类器官代表的是各来源器官的细胞结构复杂性，如 ASC 来源的结肠类器官仅由肠上皮细胞构成，而 PSC 来源的结肠类器官包含肠间充质。类器官特别是 PSC 来源的类器官的另外一个局限是成熟程度低，对于研究成人组织生物学有缺陷。下面，我们讨论如何利用其他学科技术协助克服这些缺点。
深度了解类器官
类器官是由多种细胞成分组成的 3D 结构，但具体包含哪些细胞成分还没有完全明确。这使得我们很难确定一个类器官究竟在多大程度上代表了原器官的组成和结构。单细胞测序技术可以将类器官转录信息与原器官进行很好的比对，这一技术不仅提供了类器官基因水平信息，还有助于确定细胞的分化路径，目前已应用于脑类器官和肝脏类器官。测序结果显示，脑类器官和肝脏类器官的基因表达谱与胎儿新皮层和胎儿肝脏的表达谱相似。在动物胚胎组织不同发育阶段进行测序，可以得到其各阶段的转录信息，也揭示了类器官如何真实再现发育过程。此外，RNA 断层扫描可以产生具有空间分辨率的细胞转录谱，从而提供不同细胞在器官结构中的位置信息。这些深入探究类器官特征的尝试，最终也将有助于提高类器官对原器官特征的再现性。
提高类器官成熟度
如上所述，PSC 来源的类器官的主要缺点是其成熟度有限。事实上，这种类器官更类似胎儿组织，而不是成人组织。一方面，可能因为类器官的寿命有限，限制了它们发育到后期的能力。另一方面，可能因为体外条件缺乏在体状况促进器官成熟的特定因素。例如，大脑类器官需要感官刺激才能进一步成熟，而在在体情况下，感官刺激有助于形成神经回路。对于人源类器官，延长培养周期对尤其重要，因为它们需要比小鼠类器官更长的时间才能达到成熟阶段。
类器官寿命有限的另一个原因是，一旦达到一定的大小，就不能为所有细胞提供足够的营养使其继续发育。解决这一问题的一种可能的办法是使用生物反应器，通过持续旋转培养提高养分供应。生物反应器广泛应用于组织工程领域，通过控制培养条件、促进培养条件标准化，为再生医学领域提供大量培养组织。事实上，生物反应器已将大脑类器官培养的时间从几个月延长到了一年，而且使类器官更接近人脑。
在类器官建立血管供应可以提供营养物质，延长类器官寿命。新兴的生物工程方法已经研发出血管样结构，可以富集内皮细胞并形成可灌注的血管单元。此外，利用3D 生物打印技术可以控制血管内皮细胞在类器官中的位置。虽然这些研究是在简化的细胞体系中进行的，但类器官培养未来改进可能受益于此。
另一种促进类器官血管化的方法是在类器官生长过程中掺入内皮细胞或内皮干细胞。该方法已成功应用于肝脏类器官：将人内皮细胞与人间质干细胞和人 iPSC 来源的肝内皮细胞共培养，形成具有微血管网络的肝芽。当被移植入小鼠体内后，可迅速与宿主循环系统建立连接。在人类大脑类器官，将组织细胞与血管内皮细胞各自从 PSCs中完成分化，然后将内皮细胞种植入类器官进行供血。近年有研究表明，植入小鼠大脑的人源 PSC 来源脑类器官可被宿主血管化。宿主血管化的类器官在移植后可存活 233 天，比在体外培养的对照类器官可达到更高的发育阶段，也有更多的成熟神经元、成熟星形胶质细胞、小胶质细胞和皮层特异性细胞。类器官移植体在体内可获得较成熟的表型，其他器官如肝、肠、肺等也证实了这一点，这说明体内的某些因子及血管化促进了类器官的生长和成熟。然而，一些组织的完全成熟可能需要许多年如大脑皮层于个体出生后的继续发育。要使类器官获得这些成熟特性，可能需要人为助力。对于从患者 iPSC 来源的类器官，年龄相关模型的建立更具挑战性。事实上， 随着细胞发育成熟，之前的细胞特征往往消失了。在患者来源的 iPSC 中过表达早衰蛋白来建立帕金森病病理特征的体外模型。
改善类器官结构
类器官通过“自器官化”可以产生与活体器官相似的三维立体结构，但它们的整体结构与真实器官还是有很大不同。为了解决这一问题，利用与特定组织相匹配的干细胞培养支架，可以改善类器官的结构与体积。例如，模拟结肠上皮隐窝解剖结构的微结构胶原凝胶被用于培养人类结肠干细胞，而模拟隐窝绒毛的结构已被用于培养人类小肠干细胞。在微观上，可以通过生物工程的方法来更好地调节自器官化与形态生成(例如精确地控制干细胞与周围 ECM 之间的相互作用)来改进类器官的拓扑结构。大多数的类器官实验使用天然的水凝胶基质如基质凝胶，尽管这些基质在促进细胞生长和自器官化方面非常有效，但因其成分不固定、有批间差、无法标准化，限制了类器官的定向生长。这些基质还含有动物源物质，由于存在免疫原和病原感染的风险，不适合临床应用。为了克服这些局限性，一些合成的、化学成分明确的水凝胶用于类器官 3D 培养，其化学和物理性质可以根据特定目的加以控制和优化。这些材料被用于特定类器官的培养：如脑类器官可生长在透明质酸基水凝胶中，神经管囊肿生长在聚乙二醇(PEG)基水凝胶中。此外，人工合成水凝胶培养的人体肠道类器官已成功移植到结肠黏膜创面的小鼠模型中。近日，还开发出了新的水凝胶配方，可以对其生化和生物物理性质进行时间与空间上调控，以达到更好地控制类器官形态发生的目的。事实上， 已有研究表明，人工合成水凝胶可以动态调整力学性能，使其有利于 ISC 扩展，随后诱导隐窝出现，从而产生发育完全的肠道类器官。
生物工程中的其他技术也可以用来加强对类器官形态形成和自器官化的调控，但尚未应用于与类器官直接相关的研究。这些技术包括对水凝胶生化和机械性能进行瞬时正向改变，用于动态调节类器官形态形成，并逐步诱导它们形成所需的 结构。另一个例子是光触发的切除，它可以用来主动适应基质的几何形状，以控制形态重排，利于类器官的生长。另一种想法，以新的化学材料，模仿在体内 ECM的粘弹性，使其自发对环境产生反应并通过连续调整来改善类器官的生长。
通过控制细胞聚集，也可以实现对“自器官化”的控制。3D 打印技术可以预先设定细胞团的三维空间结构，最近开发的 DNA 程序化细胞组装(DNA- programming assembly of cells, DPAC)方法也可以达到这一目的。此外，DPAC 还可辅助凝胶中小鼠胚胎成纤维细胞的形成，使胶原支架折叠，影响类器官的形态发生。
通过控制信号分子的时空分布，也可以影响类器官的形态变化。在体情况下， 细胞生长发育受局部信号分子的调控，但在体外模型中，信号分子对所有细胞产生影响。利用微流体装置或微球体释放信号分子，可以模拟在体的旁分泌样情境。在未来， 这些技术可以更好地控制类器官中细胞的发育。另一方面，合成生物学方法可以用来对自器官化的基因进行改造，如合成的 Notch 受体用于诱导哺乳动物细胞进行自器官化。
最后，数学建模还可以帮助界定在特定的自器官化过程中哪些因素发挥作用。正如对胚囊案例所讨论的，计算机模型可以预测在特定刺激条件下类器官的生物学反应。 因此，利用模型可以找到更佳的方案。
疾病类器官模型的改善
在疾病建模应用方面，类器官的局限性在于不能建立多器官病症模型。联合培养的方法可以部分解决这个问题，如人源 PSC 来源的结肠类器官和肠神经元的共培养。这项研究中作者观察到巨结肠症相关基因 PHOX2B 的突变影响了肠神经细胞的分化，导致结肠类器官平滑肌发育不良。对于那些免疫反应亢进的病症，应该在类器官中构建包含免疫细胞的血管网，以与原发病症相匹配。此外，通过将类器官培养技术与器官芯片技术相结合，生成能够再现不同器官间关联的三维体系，改进现有的药物检测平台。这种方法可以将两种体系的优点综合起来，既保留了类器官与原发疾病高度类似的特性，又结合了器官芯片技术“迷你”、器官间可相互作用的特性。此外，要进行药物筛选与个体化医疗应用，另一个关键问题是检测方法的可靠性，检测需要提供准确的结果。生物传感器在培养体系中的集成，可以提供一种定量药物理化反应、提供药物筛选特定读数的动态的自动化手段。
四· 结论
类器官能够模拟原器官的三维结构、细胞组成及生物学功能，在生物学与医学领域有广阔的应用前景。类器官与原器官的高度相似性已被广泛认同。类器官平台的应用使对人类发育、疾病的研究不再因为组织的不可获得性而受到限制。然而，尽管类器官在上述领域的应用避开了这样的伦理问题，仍然不允许体外培养人类胚胎类器官。
将类器官真正广泛应用于临床前与临床中的道路还很长。然而越来越多的研究表明，类器官在个性化医疗、新药研发、再生医学和基因治疗方面有着无可限量的潜力，在未来几十年，类器官的广泛应用必将成为现实。
干细胞在适当的 3D 培养条件下可以实现高度的“自器官化”，培养成功的类器官种类也越来越多，目前已有很多关于各种类器官应用的探 索性研究发表。同时，我们也面临很多挑战，包括如何控制“自器官化”过程，使其产生确定的、稳定的、和源组织高度相似的形状与大小；延长类器官的寿命，使其更成熟并能发挥生理功能，达到类似在体的状态；通过加入血管或免疫系统来模拟真实的病理状态等等。克服这些挑战，还需要采用多学科的手段尤其是生物工程学领域的技术与方法。
参考文献：
Rossi, G., Manfrin, A., & Lutolf, M. P. (2018). Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. doi:10.1038/s41576-018-0051-9
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