BTK激酶抑制剂疾病模型精选

布鲁顿氏酪氨酸激酶 BTK

布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK，Bruton’s tyrosine kinase)是一种胞浆蛋白,属于Tec酪氨酸激酶家族，主要在B淋巴细胞的各个发育阶段表达, 是B细胞受体（BCR）通路的重要调控因子。活化的BTK在B细胞中引发一系列的信号事件，包括BTK向质膜的迁移，酪氨酸223位点的自身磷酸化，激活下游磷脂酶PLCg2以及钙离子的释放（Rodriguez et al.，2001）。这些信号事件最终激活下游包括NF-kB在内的信号转导途径，促进细胞增殖和存活的基因表达（Bajpai et al.，2000；Petroet al.，2001）。

图1：BTK激酶信号通路示意图   

BTK在肿瘤与炎症的发生、发展过程中具有重要作用, 因此针对肿瘤治疗与炎症控制而开发的小分子BTK抑制剂受到越来越多的关注。主要疾病适应症包括B细胞淋巴癌，风湿性关节炎等。

BTK 靶点药物研发进展

1. 依鲁替尼（Ibrutinib）

依鲁替尼(Ibrutinib)是第一个上市的布鲁顿型酪氨酸激酶(BTK)抑制剂，由美国Pharmacyclics(艾伯维的子公司)和美国强生(Johnson & Johnson)共同研发。依鲁替尼(Ibrutinib)于2013年11月13日获美国食品药品管理局（FDA）批准上市，商品名为Imbruvica,该药用于套细胞淋巴瘤（Mantle Cell Lymphoma, MCL）的治疗。

2. PhiKan083 泽布替尼（Zanubrutinib）

泽布替尼(zanubrutinib)是中国百济神州自主研发的抗癌药，2019年11月15日，美国FDA宣布“泽布替尼”以“突破性疗法”的身份，“优先审评”获准上市。2020年6月，泽布替尼获得中国NMPA批准上市，用于治疗既往至少接受过一种治疗的成人套细胞淋巴瘤（MCL）以及既往至少接受过一种治疗的成人慢性淋巴细胞白血病（CLL）/小淋巴细胞淋巴瘤（SLL）。

BTK 临床前疾病模型

科途医学开发的BTK临床前疾病模型实验，包括：

• 生化药理实验

• 细胞药理实验

• 药代动力学和药效动力学实验
  

• 小鼠体内模型试验

这些BTK临床前疾病模型实验可作为BTK靶点药物研发及临床转化医学研究的工具，为新药研发企业及各大科研院所提供相关的研发技术服务。

BTK生化药理实验（BTK、ITK、Tec激酶检测）

在体外构建由纯化的激酶（BTK，ITK，Tec）、ATP、多肽底物、缓冲液体系构成的反应体系中，使用Promega公司ADP-Glo™ Kinase Assay试剂盒检测BTK抑制剂活性。BTK等蛋白和底物反应，消耗ATP，产生ADP，定量测定ADP水平，评价激酶活性及小分子化合物对激酶活性的抑制效果，计算药效剂量曲线和EC50。

图2：不同BTK激酶抑制剂的活性检测数据

BTK细胞药理实验-测定化合物对血液癌细胞系的IC50

采用CellTiter-Glo^®荧光素细胞存活率检测方法（Promega）测定药物对血液系统肿瘤细胞活力的抑制能力。在96孔板中接种一定浓度的细胞，保证检测时间内，细胞处于对数生长期，加入梯度稀释的化合物。经过数天的给药处理后，在细胞培养液中加入等体积的CellTiter-Glo^®试剂，充分裂解细胞，在酶标仪上读取荧光信号。荧光信号值与细胞活力呈正相关，通过荧光信号值，计算药物抑制细胞活力的半抑制浓度。

图3：Ibrutinib抑制Rec-1和TMD-8细胞活力检测数据

图4：BTK抑制剂在抑制一组血液肿瘤细胞系活力的选择性筛选数据

可用于该评价的血液系统恶性肿瘤细胞系包括：

BTK细胞药理实验-细胞药效动力学实验  

B细胞受体（B cell receptor，BCR）交联激活后，BTK随后被募集到细胞膜，Tyr-551残基被Syk和Lyn激酶磷酸化。BTK在Tyr-223残基进行自磷酸化后被激活。BTK被激活后，磷酸化下游底物磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Cγ2（Phospholipase Cγ2，PLCγ2）。BTK抑制剂可抑制BTK自磷酸化，也可抑制PLCγ2的磷酸化。对于一些BTK不可逆抑制剂，抑制剂会共价键结合到BTK 蛋白481位的半胱氨酸，占据BTK蛋白的该激酶区域，导致探针无法结合到该区域，通过定量检测探针结合到该区域的能力可以进行BTK抑制剂的评价。

   图5：BTK蛋白结构示意图

基于以上原理，可以在细胞水平上设计以下化合物抑制BTK激酶活性的检测实验：

• 细胞BTKpY223激酶检测

• 细胞BTK占据实验（BTK Occupancy Assay）

• 细胞PLCγ2(pY783 Alpha LIS)激酶检测
  

• 细胞ITK激酶检测

• 细胞ITK占据实验（BTK Occupancy Assay）
  

• 细胞ITK抑制对IL-2分泌影响检测
  

• 细胞EGFR激酶检测
  

• 细胞EGFR占据实验（EGFR Occupancy Assay）
  

• 细胞水平EGFR抑制表型检测（Cell Viability Assay）
  

细胞BTK占据实验（BTK Occupancy Assay）  

该检测方法是基于BTK抑制剂一旦占据BTK激酶位点，就会形成与481位半胱氨酸的共价结合，阻断其它化合物的结合。在本检测方法中，待测化合物结合细胞内的BTK激酶位点后，通过探针测定没有被化合物占据的BTK蛋白的含量，可以计算待测化合物对细胞中BTK蛋白的结合能力。该方法也可以用于BTK抑制剂动物实验和人体临床试验的药效动力学研究。

图6：细胞BTK占据实验原理示意图及Ibrutinib检测数据

BTK小鼠体内模型  

小鼠皮下成瘤实验是用B细胞淋巴癌细胞系，Rec-1，TMD-8，Mino等在小鼠皮下接种，肿瘤开始生长后给药处理，定期观测肿瘤大小和体积，绘制体内肿瘤增值曲线和体重变化曲线。

图7：小鼠异种移植REC-1套细胞淋巴瘤皮下模型中的药效实验

BTK耐药突变工程化改造细胞系及检测  

研究发现，Ibrutinib等共价不可逆抑制剂处理后，可能引发获得性耐药，其中T474（ a gatekeeper residue,）位点和C481（共价结合氨基酸）位点的突变，会导致细胞对Ibrutinib产生耐药。开发下一代非共价结合BTK抑制剂，可能重新对这些位点突变的BTK产生抑制。

• 293T-BTK-T474M细胞及检测

• 293T-BTK-C481A细胞及检测

• Rec-1-BTK-T474M细胞及检测
  

• Rec-1-BTK-C481A细胞及检测

• TMD-8-BTK-T474M细胞及检测
  

• TMD-8-BTK-C481A细胞及检测
  

• Jeko-1-BTK-T474M细胞及检测
  

• Jeko-1-BTK-C481A细胞及检测
  

• Mino-BTK-T474M细胞及检测
  

• Mino-BTK-C481A细胞及检测
  

BTK shRNA knock-down细胞系及检测  

• Mino-shRNA-NC-GFP

• Mino-BTK-shRNA-9685-GFP

• Mino-BTK-shRNA-9687-GFP

  
  

联系科途医学使用以上产品或服务：   
技术服务咨询：info@K2Oncology.com
客服电话：400-160-9699