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“下一代功能检测”参与的肿瘤精准治疗

导读


精准治疗,就是将有效药物精确地应用到每位患者,虽然我们现在还没法真正做到精准。目前,人们有一种误解,那就是把精准治疗等同于基因组学本身,但是基于基因信息而采取的肿瘤治疗非常有限,因为我们对肿瘤基因型与表型之间的关联事实上还知之甚少。利用患者肿瘤细胞进行功能性检测或许可以解决单凭基因信息指导治疗的局限性。最近,几项下一代功能检测的新技术,包括肿瘤模型构建、精准的肿瘤应答分子水平试验和肿瘤原位检测技术打破了一代药敏测试的局限性下一代功能检测应用前景广阔,并且可以结合下一代基因测序与传统的病理免疫技术,来实现精准医疗。





特异性针对某些信号通路或细胞亚型的新抗癌药物不断涌现,如何将这些有效药物与目标患者匹配是我们要解决的问题。目前,主要通过分子水平的检测信息(通常是基因检测)来匹配患者与靶点药物,但肿瘤不同于罕见遗传病(罕见遗传病通常是单基因突变),肿瘤除了基因驱动外,还有表观遗传改变、细胞系特异性和非癌因素等的复杂性。NGS的突飞猛进为我们揭示了导致肿瘤的数万种突变,这些发现彻底改变了我们对癌症的理解。随着大量癌症基因被检测,我们正在发掘的信息可能是长尾效应(long tail)里发生在一小部分患者肿瘤中的突变。从表面看,我们似乎已经发现了决定抗癌药物开发方向的哪些高频突变位点,但事实上临床结果显示只有不到10%的患者受益于FDA批准的靶向药物。伊马替尼治疗慢性髓系白血病(CML)BCR-ABL突变患者的奇迹至今还无法在其他癌症治疗中复制,伊马替尼开启了癌症基因治疗的一个新时代,超过90%的患者对药物有应答且有长期疗效。对于新发现的基因突变,我们希望了解其功能并使其成为指导治疗的生物标志物,但迄今为止,我们对成千上万种肿瘤突变基因引发的功能改变知之甚少,需要有新的复合性方案来帮助患者找到对应的治疗方案。


罕见遗传病的治疗取得了成功,人们希望将同样的策略应用到肿瘤领域。但是,肿瘤和免疫系统疾病与罕见遗传病的明确不同在于存在细胞复制驱使的微进化过程。抗肿瘤免疫系统会根据肿瘤系统的微进化同步发生微进化。这解释了为什么在少数患者中,肿瘤免疫有时候表现出稳定长期疗效。然而,基因组学和病理学技术通常是对疾病的描述性、静态性检测,是在已死亡癌细胞基础上对整个肿瘤发生过程的总结。因此,尽管NGS可以为某些特定亚群患者提供预测依据,对于更大受众面的患者,需要有除NGS之外的其他方法结合使用来进行治疗方案选择的指导。

功能性检测能真正动态描绘和评估肿瘤细胞易损性。只要是能够监测肿瘤细胞状态并指导治疗的检测方法都可以归入功能性检测,例如,将活检组织在体外加药后检测肿瘤细胞死亡。功能性检测通常用在感染性疾病的抗生素筛选。在癌症研究领域虽然这些方法已经应用半个多世纪,但由于缺乏足够的临床证据,仍然很难广泛推广。第一代功能性检测虽然没有得到临床应用,但针对肿瘤细胞的体外功能性检测仍然充满吸引力。本文概述几种最近在功能性检测领域的进展,包括肿瘤模型构建和培养、肿瘤药物反应检测。功能性检测的临床前及临床试验将为肿瘤学家带来预测性的实用信息。


下面将通过8个部分对文中提及的技术进行详细解读:




·第一代功能性诊断



要准确预测一个复杂体系(如癌症)的生物学行为,我们既需要了解其初始状况(如基因、转录组、蛋白质、代谢物等),也需要了解该体系各组分之间的动态相互作用(如基因与RNARNA与蛋白质、蛋白质与蛋白质相互作用)基因信息仅提供了肿瘤初始状态信息——即该细胞在长期致癌因素作用下基因损害的最后结果。虽然对癌细胞各组分之间的相互作用如在致癌因素刺激下蛋白质-蛋白质相互作用及转录过程有初步的了解,但无法据此预知更多信息。然而,外来干扰对一个复杂体系会产生很多搅动,这是非单一的基因检测能体现的,需要功能性检测来完善对肿瘤的理解。通过重复活检或监测循环肿瘤DNActDNA)的变化,在药物治疗前后分别获取基因变化信息,可以使人们对治疗中产生的耐药性机制有深入的了解,但对具体的患者并没有提供直接可行的治疗方案。例如,即使发现针对某一位点的新型突变,针对该突变靶点的药物研发仍然是一个漫长的过程。相反,直接用肿瘤细胞进行药物敏感筛选可以快速应用到临床。



BOX 1:根据基因型进行患者分层的前景与局限

癌症研究者和临床医生的共同目标是为患者匹配合适的治疗方案。NGS是目前解决此问题最好的途径。肿瘤不断产生基因变异,难以找到真正的驱动突变。即使找到明确突变,单药靶向治疗可能也只是短暂起效。伊马替尼治疗慢性髓系白血病(CML)开创了现代癌症基因治疗的新时代,但遗憾的是,迄今为止还没有其他靶向药物有这样卓越的疗效。近来取得成功的靶向治疗,如针对BRAFV600E突变型黑色素瘤的靶向药维罗非尼、针对表皮生长因子受体(EGFR)突变型非小细胞肺癌(NSCLC)的吉非替尼和针对间变性淋巴瘤激酶(ALK)突变型非小细胞肺癌的克唑替尼,均未能复制伊马替尼在CML患者中的疗效,只有短期局部疗效。只有约半数FLT3突变型白血病患者对特异性FLT3抑制剂有短期疗效。对其他一些针对驱动突变的靶点药物来说,其疗效可能还与肿瘤细胞系、肿瘤微环境相关,如BRAFv600E突变型结直肠癌患者对BRAF抑制剂就无明显应答。

虽然有超过80%的患者都携带有未知功能的基因突变,但只有不到10%患者的突变型为临床明确证实的驱动突变。那些未知功能的基因突变大多需要数年的新药研发后才能揭示其功能。这种交叉指向的推论基于如SIGNATUREMATCH Lung-MAP这样的篮子试验或者雨伞试验,但是,这种试验也面临招募罕见突变患者困难的问题,而且除了众所周知的如EGFRALKBRAF的抑制性应答,其他突变还知之甚少。【:美国癌症研究学会(American Association for Cancer ResearchAACR 2014年的癌症进展里面特别指出, 针对精准癌医学的创新性临床试验可分成两大类,一类称为Basket Trial,即篮子试验。形象点儿说,某种靶点明确的药物就是一个篮子,将带有相同靶基因的不同癌症放进一个篮子里进行研究就是篮子试验,“Basket Trial”的本质就是一种药物应对不同的肿瘤。第二类临床试验称为Umbrella Trial,即撑起一把大伞,把具有不同驱动基因的肺癌,如KRASEGFRALK 拢聚在同一把雨伞之下,这把大伞,就是将不同的靶点检测在同一时间里完成, 然后根据不同的靶基因分配不同的精准靶药物。Umbrella试验的最大优势,在于将非常少见的突变事件集中起来,变少见事件为常见事件,这无论对加速少见疾病的临床试验还是对于某一个个体获得精准治疗的机会,都具有特别的意义。】鉴于目前可检测的单药治疗应答短,我们推测该领域将转向组合靶向治疗。然而,组合疗法对分离对应的遗传特性应答提出了更高的要求;的确,在复杂的基因调控中,只有<5%NSCLC患者确实受两种突变共作用影响。

此外,在全基因组测序识别出的数千个突变中,只有一小部分可能成为药物靶点的有意义数据。甚至非同义突变也会影响细胞状态。影响程度尚不清楚,有可能是大量相对较小的影响积累导致了癌症,所以直接靶向任何一个或数个,可能作用较小。尽管许多靶向药物未能匹配体细胞基因型或驱动突变,仅匹配了细胞系,但仍疗效显著;例如,CD20的抗体,布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)的抑制剂和慢性淋巴细胞白血病(CLL)PI3Kδ抑制剂。这些非致癌基因缺陷和多种多样的表观遗传变化广泛存在,但无法通过基因测序展现。癌症基因组和表观基因组的复杂性表明,我们正处于解读数据并将其转化为可指导临床的知识的早期阶段。因此,我们需要新的、正交技术与NGS一起,加速癌症精准医疗。



直观来讲,功能测试是用患者的肿瘤活检样本进行药物试验。通过细胞死亡量衡量肿瘤应答效应,然后指导治疗。第一代功能测试版本在过去三四十年中有较详细的研究,有若干类别,近期几篇评论中有很好的总结,本文暂且不作赘述。早期的方法包括人源肿瘤克隆原性试验(HTCA)、差异染色细胞毒性试验(DiSC)、极端耐药试验(EDRA)ChemoFx试验(Helomics, Pittsburgh, Pennsylvania, USA)和肾包膜试验(SRCA)。其中一些方案,如HTCAChemoFx,培养患者的肿瘤细胞,产生同质的肿瘤细胞团或细胞系;加入化疗药物后,通过细胞计数、代谢性四唑染料(MTT)或基于全细胞ATP量读出的细胞数量等方法检测细胞活性。其他一些方案直接检测化疗3-7天后,患者活检组织中肿瘤细胞和基质细胞的变化。大多数研究仅限于传统的细胞毒性化疗药物,而很少设计前瞻性实验、对照实验、随机实验等,评估能否改善患者预后这一中心问题。在一项卵巢癌的试验中,为指导患者实际化疗,体外组织用药6天后使用了一种基于ATP的检测方法,表明无进展和统计学意义改善。近期一些综述提到,这些化疗敏感性和反应试验的临床数据并不足以证明这些试验可日常使用。然而,尽管试验、用药和研究设计不同,但过去几十年的大多数研究偏向于预测化疗耐药性这一应用。然而,这些测试并未成为一种公认的标准手段,而且大家越来越多集中于关注肿瘤发生的遗传原因,作为筛选治疗的新途径。




·肿瘤模型构建新方法



患者样本的药敏实验要求患者自身活的肿瘤细胞,但这对于体外培养和搭建实体肿瘤模型可能颇有挑战。传统方法生成患者个人用于功能检测的稳定细胞系,凭借二维培养皿、基础类型培养基进行细胞培养,费力且失败率高。这种同源细胞系无论在基因型水平(例如突变和表达谱),还是在表型水平(生长速度更快,化疗敏感性增加)上都具有与亲代肿瘤不同的特性;更重要的是,这些细胞系失去了患者肿瘤的功能和基因特异性,以及支持肿瘤生长的肿瘤-基质相互作用。例如,核心活检,这类只能从患者体内获取少量组织的方法会大大增加培养的难度。因此,获得足够数量的细胞进行功能测试一直是以往建模方案的重要难点。


1. 环境型重置以培养患者肿瘤组织

最近发表的一种可快速获取大量组织的方法为条件重编程(CR)。该方法使用辐照成纤维细胞滋养层、生长因子富集培养基和RHO相关的蛋白激酶(ROCK)抑制剂,可快速扩张患者的良性或恶性组织。CR可能是通过诱导产生快速、可逆的表观状态达成,类似于成体干细胞,以上调端粒酶逆转录酶(TERT)、整合蛋白、p63亚型、CD44和核连环素的水平,减少Notch信号,但不包含诱导多能干细胞的诱导特性。此外,近期数据表明,CR保留了瘤内的遗传特异性,可以在活检组织基础上数倍扩增。一项报告表明,一例乳头瘤病毒(HPV)诱导的呼吸性乳头瘤病患者通过CR来源的肿瘤模型进行体外伏立诺他药检,显示出了长期应答。

更近期的一项实验中,Crystal等研究者使用CR技术针对临床耐药性非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)患者,建立了大量体外肿瘤模型。该方法不依赖于现有细胞系中观察到或诱导到的耐药性,而是生成反映患者产生的真实耐药性的细胞系重要的是,作者观察到在这些体外培养模型中原生的驱动突变持续存在,对单药耐药性也可保持如初。这些细胞系用于识别MEK和间变淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)的全新组合疗效,可解决ALK突变型NSCLC对单药ALK抑制剂的耐药性。但值得注意的是,测序可发现肿瘤患者多个潜在的、可发展的突变;虽然观测到的MEK突变可以解释MEK抑制剂的敏感性,但也观测到其他暂无关联的突变,如存在Janus激酶(JAK)突变,但JAK抑制剂无效。因此,作者提到,药物筛选可以用来分型基因决定的潜在缺陷。在将CR技术用于常规药敏检测之前,需要对其进行若干改进。由于这种方法能迅速培养组织中所有实体组分,因此,需要增加一些步骤,将肿瘤组织与非肿瘤组织分离,如差别胰酶消化、广泛继代培养或单细胞克隆。此外,2D单细胞层培养可能要求产生大量的同型细胞进行测试;在这段生长时期,细胞可能会偏离其原始表型,会推迟相关研究的进展,限制临床应用。


2. 循环肿瘤细胞

近年来,从癌症患者血液中分离和继代培养循环肿瘤细胞(CTCs)的方法有了显著改善。旧式方法或要求短期内将CTCs移植到动物体内进行传代,或面临成功率很低的状况。最近,利用改进的CTC微流控芯片从乳腺癌患者中分离出CTC,富集的CTC可进一步培养。为培养这些分离细胞,研究者们发明了特定的培养条件;有趣的是,CTC只有悬浮培养,而非粘附培养环境下生长才能成功,这与细胞原本的循环状态一致。这种培养不仅对药物筛选研究有意义,更会提供丰富的肿瘤组织进行更全面,更深层的测序样本。药物筛选结果显示,CTC来源的细胞对化疗的功能性应答与患者的临床反应一致,也可推测一些药物组合效应。CTC可仅从血液样本中获取,这为患者继行试验提供了可靠的样本来源。这种筛选甚至如同光学标记药物库证明的那样,可以在CTC悬浮微流体室直观进行(而不是在传统的筛选板上);进一步改进这些设备,使基于患者细胞的药检自动化成为常规检测,还需要进一步的探究。然而,与其他CTC方法一样,通常患者分离细胞少于100 (有时无法分离细胞)需要数月的生长才能获得常规检测所需的细胞数,这段时间内的原发肿瘤可能与扩增的CTC细胞产生差异。


3. 人源类器官

另一项扩增患者肿瘤组织的平台是人源类器官平台。将分离得到的患者来源细胞于半固态、富含生长因子的培养基中培养,可得到类器官。类器官在三维空间中生长有独特优势,内部结构时常发生重组,理论上比二维培养皿培养能更好的再现体内肿瘤环境。最近,胰腺癌、前列腺癌和结肠癌患者均建成了类器官。类器官具有和原发肿瘤相同的驱动突变。与CR建模方法一样,类器官通常含有正常的上皮细胞,得到可进行药检的组织需要数周,建模成功率很大程度上取决于样本来源。在应用于常规检测之前,还需要进一步的改进和临床验证。但可以提供早期指导:最近前沿探究表明,从结肠直肠癌患者中可生成类器官,并进行了与原样本组织的对比验证。尽管初始活检样本培养生成类器官时出现了选择性克隆,但已生成的样本显示,除形态学不同和增殖速率不同外,类器官样本完整保留了已知致癌基因。一部分类器官随后进行了相关癌种的药筛,展现了患者特异性缺陷。尽管一些药物效用可能与患者特异性突变有关,但还存在一些与基因型似乎无关的药物反应,这更加展现了功能性信息的临床参考价值。


4. 器官化培养

上述方法均可产生同源细胞,但主要问题在于无法维持原生肿瘤的三维环境,或保持原始肿瘤的特异性混合基质细胞。患者体内特异性细胞作为一种重要的生物标志,可能成为一种预后和预测特征;而肿瘤细胞环境可以显著影响治疗应答。为了解决这些问题,研究者开发了根据多种细胞类型建立的人工器官模型,其基因表达模式更类似于肿瘤,而非二维培养;使用细胞系进行的培养证实可预测体内结果。其他研究结果表明,原发肿瘤活组织薄片通过商业化培养皿培养可用于药物治疗;且现有条件下,肿瘤细胞对抑制剂表现出部分通路应答。也可以利用状如微球体的大块肿瘤碎块进行药物处理,从而代替单细胞用药方案。

最近,研究者改进了原有的器官化培养方法,在体外用药期间更严格把控条件,重建内源性肿瘤微环境。作者将患者肿瘤薄片与患者自体血清中的胞外蛋白结合培养,在微量滴定板(microtitre plates)中重建特异性肿瘤环境。根据标准定量试剂对比,这种方法能更真实地重现肿瘤结构、增殖、ATP活性和信号通路激活状况。最后,通过监测多种肿瘤反应(如生存能力、增殖和凋亡),并结合这些数据推算,得出的标准化疗组合疗法的体外反应在头颈部鳞癌和结肠直肠癌样本中与临床结果一致。整体而言,这种预测方法准确率87%左右,数据可信,证明此种方法可能有助于前瞻性地指导治疗。随着新型免疫调节剂的开发和反应预测标志物的发掘,在这些三维培养中加入免疫细胞可能会提供更精准的肿瘤-免疫系统互作模型。


图一:肿瘤模型构建新方法




·原位功能性诊断



没有一种体外方法能够准确地复刻人类肿瘤的情况。因而,另一种方法是通过新技术,直接对患者体内实体瘤进行微剂量药效测试。最近发表的两篇文章描述了不同的微剂量技术。第一项研究中,显微操作针注射装置(CIVO; 美国西雅图,华盛顿,Presage Biosciences )直接向异体肿瘤内注入小剂量药物24-72h后,进行肿瘤离体组化分析,包括药物毒性及信号通路检测。该肿瘤的细胞毒性反应与全身给药反应类似。进一步将该方法用于患有淋巴瘤的人类和狗类模型中,取得很好的耐药性。第二项研究中,利用活检针植入一个含有16种不同缓释药的小装置,肿瘤原位处放置24h,然后取出肿瘤并检测药物应答。利用这种小鼠异体移植,研究者观察到化疗用药时每个病灶的细胞凋亡指数与全身肿瘤应答之间的较强关联性。


这种临床技术的发展面临一些潜在的问题。它们的使用范围仅限于特定大小的实体肿瘤,并且,需要附加可能存在风险的用药后从患者体内取出肿瘤的步骤,这些问题引人深思。此外,监管、规范和分析该装置的药物扩散过程,并将绝对应答和相对应答与已知药代动力学关联起来,是一件具有挑战性的事情。特别是考虑到瘤内流体压力和肿瘤-基质混合物方面的患者自体的特异性,将面临更多挑战。即使临床证实之前,它们最直接的用途可能仅用于临床前药物研发,可在体内同时验证多种新的治疗方案,然后进行实验性治疗的早期临床药效学概念验证研究,然而,这两种实验方法都显示出预测系统治疗应答方面药敏测试的价值。




·用于功能性检测的小鼠模型



另一种患者来源的异种移植物小鼠模型(PDX),可更准确地模拟内源性肿瘤生长环境,成为患者肿瘤药物测试的化身PDX模型将患者活检组织皮下或原位植入后体内扩增,理论上优势在于保留了患者肿瘤的部分组织学、基因表达和体细胞遗传学信息。PDX模型不仅逐渐成为药物研发中测试效益的标准,也用于筛选患者治疗。在这些PDX方案中,可行的治疗方案先在患有活体肿瘤的小鼠身上进行试验,然后选择肿瘤缩小或生长放缓的药物,推荐患者采用。虽然截至目前,这些数据仅限于日常研究或小型非随机试验,但一些PDX平台的初始数据,如PDX引导的治疗方案应答率为81-88%,还是具有很强的说服力。


人源肿瘤异体小鼠模型还存在一些现实的问题。第一,时间问题,测试一种或多种治疗方案需要足够多的小鼠体内产生足够的肿瘤组织;这通常需要6-8个月,甚至更长。第二,携带单个患者肿瘤的小鼠克隆实际上仅可测试几种药物。第三,培养得到数组小鼠中足够进行检测的细胞需要额外的时间,这对患者各类肿瘤克隆模型的表达有明显的影响。例如,在一项关于乳腺癌PDX小鼠模型的大型研究中,甚至在第一代小鼠中,所有模型都表现了从中度转移到剧烈的克隆选择程度不等的肿瘤生长选择。另一项更小型的研究同样显示,从患者肿瘤的全外显子组测序中发现的突变,与传代2代的PDX模型中发现的突变之间存在大量差异。最后,在免疫缺陷小鼠中建立PDX模型,会降低模型与原始肿瘤环境的相似性,包括基质成分和免疫细胞相互作用。虽然我们依然寄希望于PDX模型,但还需要更大规模的前瞻性、随机的试验获得更可靠的证据,来为更多患者提供治疗选择。



               “ 功能性筛查,包括传统病理学技术和基因测序,将成为一种新兴的综合诊断方法。

                                                                                                                               ——作者按




·白血病的功能性测试




上述新方法大多都试图解决实体肿瘤生存、生长和检测方面的棘手问题。与之不同的是,白血病和其他恶性血液病则很容易进行功能性检测的临床转化,因为从简单的抽血或骨髓活检中,很容易获得大量、包含活的恶性细胞的单细胞悬浮液。在过去的几年中,一些小组已经开始试用先进的高通量方法来体外检测白血病应答以及这些应答与患者预后的相关性。

例如,Tyner等人针对患者样本开发了一种高通量筛选方法。该方法最初用于识别原发性肿瘤样本中以RNA干扰为基础的靶点,后来研究人员对该系统进行了调整,针对150多个人源白血病原样本筛选大量疗法,也包括临床相关的靶向疗法。使用高通量技术筛选患者样本,得到的抑制剂活性的临床有效性和抑制剂靶向图谱叠加,对比多种可杀死细胞的药物的常用靶点。因此,突变型FMS样酪氨酸激酶3内串联重复(FLT3- ITD)阳性、急性髓系白血病(AML)患者的细胞被靶向FLT3的药物杀死,而BCR - ABL阳性CML患者的细胞被同时靶向ABL 的药物杀死。在一项病例研究中,一名患者根据体外应答测试接受了激酶抑制剂索拉非尼治疗。结果引人深思,体外测试显示患者随后的样本对索拉非尼具有相同的药敏性,但临床表现耐药性;而另一激酶抑制剂舒尼替尼的体外反应没有变化,说明索拉非尼特异性抗性应答。值得注意的是,对每个患者来说,特异性和最强效用的药物各不相同;许多情况下,会由此发现FDA已批准药物的新的适应症。该平台在儿童白血病的病例研究中得到了进一步的验证,也验证了活检样本足够大的实体肿瘤,例如肾细胞癌和犬骨肉瘤。该平台的临床效用目前正在一项复发型AML的前瞻性临床试验中进行测试。ClinicalTrials. gov identifier: NCT01620216


通过类似的筛选试验,Wennerberg和他的同事们开发了一种高通量的体外试验,利用患者活检样本,进行单独或联合靶向治疗试验。一组实验中,作者收集28AML患者的骨髓活检样本,开发了一个药物敏感性和耐药性测试(DSRT)平台,检测了187种药物在用药72小时后对细胞活力的影响。为了更明确地对药物反应进行评分,研究者研发了一套名为药物敏感性评分(drug sensitivity score, DSS)的计算体系,对比单个患者的用药前后及不同剂量用药应答情况。该方法发现了多种未获批准用于AML但可以有效杀死患者AML细胞的药物。虽然按不同方面将样本类型分几种药物敏感型组别,但最有效的药物具有个体特异性,因而也展现了个性化用药的必要性。又例如,FLT3突变型AML患者对FLT3抑制剂具有敏感性,表明药物应答可能与已知的突变相关,进一步验证了现有肿瘤生物学理论中体外反应的一致性。最近,这种方法识别了血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂阿西替尼的一种新的靶外效应:具体来说,它抑制了管家基因T315I 突变型BCR-ABL患者,研究发现患者对这种药物具有适应症外效用。

在处理恶性血液疾病(尤其是AML)样本时,细胞的脆弱性是一大挑战,因为体外操作在即使无药物作用下也可迅速导致细胞死亡。此外,特别是那些接受过多次化疗的患者,许多患者会出现骨髓细胞数目减少,限制了检测的细胞数量。近来关于AML细胞的生存条件和预试验扩增条件的研究,可用于探索低剂量地西他滨对原发性AML细胞的影响。类似于固体肿瘤CR培养,这些技术利用滋养层和生长因子富集的培养基,为细胞短期增殖提供合适的条件。

虽然目前,体外患者样本检测已作为常规的生物学检测用于恶性血液疾病、药物研发当中(例如,近期,在30个慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者中, 卡非佐米和依鲁替尼联合用药证实有效),但其用于诊断的全部潜能尚未完全发掘。这些研究表明,这种直接的患者测试可能会在并不了解患者突变情况或生物信息情况下直接使患者受益,这是对临床状态的补充;当药物适用于特定突变,就会对患者受益。




·体外肿瘤应答的新测定方法



所有的功能性分析都将以某种药效检测而告终。上述研究无论采取人为测量还是自动化计数,大多以细胞死亡数目作为指标,如细胞内ATP浓度、细胞计数、增殖或凋亡的特定细胞标记物。这些指标是令人信服的,因为细胞杀伤可以转化为患者化学敏感性导致的最终疗效。然而,大多数的测量技术需要将肿瘤样本与药物共培养一段时间,观察共培养时间内整体环境的基质和多方面相互作用、氧张力、温度、代谢物等参数的现象。最近,人们展现了几种体外更为特殊的分子测量方式


1. 测量靶向位点

靶向位点测量可能与在分子水平上确定的患者亚群中的应答相关。因此,研究人员开发了针对患者活细胞或活细胞裂解物为测量目标的技术,从而可以预测患者的应答,而不是在给药后对该通路进行静态测量。它们的优点是使用明确的分子试剂,而且通常时效性强。例如,BRAF突变型黑素瘤患者MAPK活化,而突变特异性、泛BRAFMEK抑制剂的调节通路与治疗反应相关。一种技术是使用激酶底物多肽芯片(kinase substrate peptide microarrays),上面布满来自患者的裂解样本,然后检测底物的磷酸化。黑色素瘤患者的组织样本中,难以通过底物磷酸化测定的基本激酶活性,区分黑色素瘤的主要基因型(BRAFNRAS、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A (CDKN2A)TP53发生突变的基因型);只有在体外用含有BRAF抑制剂维莫非尼的裂解液时,这些基因型之间的激酶才能区分,这表明功能性检测数据在患者分型中的重要性。这样的测试可以用来确定特定药物应答,也可以通过识别患者样本中高活性靶点,推荐新的治疗方法。另一种不同的技术,利用体外平台测量活黑色素瘤样本对BRAF抑制剂反应后的磷酸化(已激活)ERK,预测到一名BRAF突变型患者对BRAF抑制剂无应答。


2. 测量激活途径

同时检测多个通路可能比检测单个通路能更好地预测结果。这种活细胞信号通路的分析在白血病中得到了广泛的应用,充分利用了血液细胞更加均匀和易于获得的优势。早期研究使用多参数荧光活化细胞分选仪(FACS)监测了AML患者加入多种信号配体后的多个信号通路状况,从而发现患者特异性亚群。在这项工作的基础上,同时监测了药物筛选下白血病细胞系和小鼠初代脾细胞的多种途径。将此平台用于临床,能够识别完整的成人和儿童AML患者,细胞因子和化疗双重作用下完整应答展现的通路调节机制,再现性高(皮尔森系数> 0.8);被试者试验特征曲线下面积(AUC of the ROC; 一项真假阳性率指标)0.660.7(最大值为1.0)AML的中度风险临床类别中最高可达0.88,所以用于预测的新型生物标志物对这类判定十分必要。


3. BH3性能分析

绝大多数的靶向治疗通过最终线粒体死亡方面的监测基本有效。以这种常见的作用机制为出发点,近期我们发现了一种更快速的方法,可以在数小时内检测体内药物反应,从而避免长期体外培养,克服了这类第一代药敏分析的一个主要障碍。此前,我们开发了一种系统,通过对BCL-2同源域3 (BH3)的分析来监测体外患者肿瘤的死亡阈值。通过将渗透化肿瘤细胞和插入BH3结构域的多肽混合,并测量线粒体透性,我们观察到一些患者的细胞更容易失去线粒体活性;这些代表多种白血病和实体肿瘤的患者,对细胞毒性化疗更敏感。我们最近对静态BH3分析进行改进,变为动态BH3分析”(DBP):在DBP方法中,患者细胞首先体外用药16-24小时,然后进行BH3分析。数日后围绕固态肿瘤和血液肿瘤细胞系进行分析,结合传统的生存能力分析线根据粒体激发键【 Mitochondrial priming。已有很多研究证明在发生细胞凋亡的过程中,细胞死亡调节蛋白以线粒体作为靶细胞器,并影响其生理功能。由于线粒体是细胞生命活动控制中心,它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心,而且是细胞凋亡调控中心。因此,线粒体的结构与功能不仅与细胞凋亡密切相关,线粒体功能的丧失无疑会导致细胞的死亡。Ni Chonghaile博士等人将细胞凋亡相关信号传导的干预蛋白质通过线粒体外膜的能力称为Mitochondrial priming,并研发了相关的检测与评价方法。近年来,Ni Chonghaile博士等人通过采集不同患者的肿瘤样品实施检验,并对化疗效果进行追踪调查。结果证明,化学疗法效果与肿瘤患者的线粒体Mitochondrial priming表达水平呈正比相关性。】预测最终的药物反应,受试者操作特征曲线下面积(AUC of the ROC)为0.89。然而,更重要的是,DBP结果可以预测患者对药物的反应:CML患者样本中伊马替尼诱导的线粒体激发键与临床对伊马替尼的反应相关,而卵巢癌患者样本中顺铂诱导的线粒体激发键表达增加表明无进展生存期的显著增加。有趣的是,在一系列分子靶向信号转导抑制剂和细胞毒性化疗中,结果是一致的。因此,DBP可能适用于目前使用的大多数常规或靶向抗癌药物。DBP能否预测的所有药物种类还需要更大的患者样本的探索,其具体应用还需要进行临床试验验证。

这些技术的巧思在于,它们将复杂的活细胞监测范围缩小到到明确的分子相互作用中。通过患者预后的对比,可确认活检组织中这些过度活跃的靶点和通路是真正的缺陷或驱动因素。在过去的几年中,发现了许多新的分析方法,提供了患者活检样本的功能信息,包括阻抗谱(impedance spectroscopy,主要是用于得到材料界面上迁移和微结构之间的关系)法监测体外活的黑素瘤样本对化疗反应及代谢产物,如耗氧量等。类似于增殖、生存能力和凋亡方面的监测,这些方法将需要与患者预后进行相关性评估,并比较除试剂、时间和分析的技术差异外,每种检测的优缺点。


图二:BH3检测图示




·功能性临床验证



下一代功能性检测方法旨在帮助肿瘤学家在实践中为患者选择最佳治疗方案,并作为实验性疗法临床试验部分的分层测试。与所有有关NGS的单基因和多基因预测生物标志物(包括单基因和多基因通路)一样,此类检测需要对其分析有效性、临床有效性和临床实用性进行严格评估,向患者证明其价值,并应用于临床。这些测试参数已被广泛应用于分子技术,许多相同的标准可应用于下一代功能诊断,包括严格的质量控制和质量保证措施,测试结果与临床反应的相关性是否显著且有意义,最后进行临床效用的随机对照试验。这些标准对于明确功能性试验的监管和医保情况至关重要,其中大多数试验可能作为实验室开发的测试(LDT)在中心实验室中进行。在美国,医疗保险和医疗补助服务中心(CMS)历来根据《临床实验室改进修正案》(Clinical Laboratory Improvement AmendmentsCLIA)LDT进行监管,因为FDA在临床使用前已行使其执法裁量权,因而不要求获得正式批准。然而,该机构最近宣布了一项框架协议,要求对特定的LDT,特别是那些被列为高风险的LDT,进行正式批准,这一立场得到了美国癌症研究协会的肯定。考虑到定制化的功能性试验可直接为患者的治疗方案提供参考,如果指南被采纳,它们很可能会受到相应的监管。因此,定制良好的临床试验将需要证明功能测试的临床有效性和实用性,然后才能推向更广泛的市场。


BOX 2:临床癌症治疗新诊断技术的验证

分析性验证

分析性验证是一种数据汇编,它表明测试以确定的精度、准确性、专一性和敏感性度量它要度量的内容。与下一代测序(NGS)不同,传统的测序方法可以作为黄金标准,成为新方法的标杆,以客观地判断是否存在突变,而功能测试通常是相对于细胞活动的内部调控进行检测,没有明确的标准。此外,最近人们注意到细胞筛选试验中的干扰项,特别是与基因组特征相关的干扰项。这种干扰项可以通过严格的化验标准化来解决。一项功能分析应该具有表观现象精准的量化,如果相同细胞终态低通量,也可通过正交试验进行对比;而且应该具有一定范围和通量内如再现性,一致性和稳定性等易于明确的性能特征。一些工作流程的分析参数可以使用标准癌细胞系作为支持数据进行验证。

临床有效性

临床有效性,或生物标志物与临床反应的相关性,可从患者反应的回顾性研究和分析结果中获得。对于功能筛选,这样的评估在回顾时更难执行,因为很少有患者的样本被常规保存同时保留细胞活力。然而,鉴于将基因突变与药物反应联系起来的数据目前还十分有限,从样本中对这些靶向治疗的体外反应与这些突变之间的相关性,可以获得功能测试临床有效性的替身。更确切的临床有效性可以从回顾性-前瞻性试验中获得。在这些试验中,在临床治疗的同时收集样本并进行测试,然后进行体内测试结果与临床结果的比较。

临床实用性

鉴于日益复杂的临床生物标志物带来的成本和风险,越来越多的人认识到临床生物标志物证明临床效用或改善患者预后的证据的重要性。这种评价的黄金标准是前瞻性试验,将患者随机分为两组,一组接受引导试验治疗,另一组接受适当选择的对照组(例如,非引导试验但相同的药物菜单或肿瘤学家的选择) 。然而,考虑到此类试验所需的规模和成本,即使是对临床疗效的中等预期,功能预测试验也可以在较小的非随机试验中进行,这些试验测量的是晚期癌症人群的总体反应率,对新疗法的历史反应率预计将较低。将这种方法应用到临床实践中,将有助于对患者进行有效的分类,以便对其进行护理标准治疗,而不是进行测试新组合策略的临床试验。当然,对于绝大多数分子靶向治疗不可用的癌症患者,可以在前瞻性试验中立即对试验指导的治疗进行评估,以表明可以可靠地预测持久的反应。正如NGS方法正在跨肿瘤类型或跨篮子试验雨伞试验类型试验中的多种药物进行评估一样,功能分析可以通过针对特定肿瘤类型(雨伞型)的特定药物面板或跨多个肿瘤类型(篮子型)的单一药物面板进行验证,这取决于分析的灵活性。




·结论



功能测试通过在没有先验知识的情况下提供病人细胞的反应来补充遗传测序药物活性的机制。鉴于肿瘤学中功能测试的直观和令人信服的基本原理,近年来人们对下一代功能诊断重新产生兴趣也就不足为奇了。与任何新的临床生物标志物一样,这些试验将需要临床验证,以证明此类试验能够为患者提供持久的益处,从而在常规肿瘤学治疗中得到采用。我们设想,未来3-5年的此类试验将最终确定具体的临床场景,在这些场景中,下一代功能测试将有助于指导肿瘤学家为其患者选择正确的治疗方法。因此,这类测试还可以防止患者可能对其具有耐药性的治疗药物的不必要使用,降低毒性和成本。


目前,NGS等分子治疗方法正被用于体细胞癌症突变的治疗。我们相信,对于大多数癌症患者来说,这些信息本身是有限的。功能性筛查将成为一种新兴的综合诊断方法的一部分,该方法包括传统病理学技术和基因测序。在这种模式下,治疗前单个患者的活检样本可应用于多种诊断技术,从而在大量的单一或组合药物组成的军械库中,挑选个性化的最优方案。只有通过这样一幅全面的图景,数以百计的靶向疗法和免疫疗法的新兴群体才能与癌症患者个体精确匹配。




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参考文献:

Friedman, Adam A., et al. "Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics."

Nature Reviews Cancer 15.12 (2015): 747.