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BTK激酶抑制剂疾病模型精选

布鲁顿氏酪氨酸激酶 BTK


布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK,Bruton’s tyrosine kinase)是一种胞浆蛋白,属于Tec酪氨酸激酶家族,主要在B淋巴细胞的各个发育阶段表达, 是B细胞受体(BCR)通路的重要调控因子。活化的BTK在B细胞中引发一系列的信号事件,包括BTK向质膜的迁移,酪氨酸223位点的自身磷酸化,激活下游磷脂酶PLCg2以及钙离子的释放(Rodriguez et al.,2001)。这些信号事件最终激活下游包括NF-kB在内的信号转导途径,促进细胞增殖和存活的基因表达(Bajpai et al.,2000;Petroet al.,2001)。

BTK激酶信号通路示意图.jpg

图1:BTK激酶信号通路示意图   


BTK在肿瘤与炎症的发生、发展过程中具有重要作用, 因此针对肿瘤治疗与炎症控制而开发的小分子BTK抑制剂受到越来越多的关注。主要疾病适应症包括B细胞淋巴癌,风湿性关节炎等。


BTK 靶点药物研发进展


1. 依鲁替尼(Ibrutinib)

依鲁替尼(Ibrutinib)是第一个上市的布鲁顿型酪氨酸激酶(BTK)抑制剂,由美国Pharmacyclics(艾伯维的子公司)和美国强生(Johnson & Johnson)共同研发。依鲁替尼(Ibrutinib)于2013年11月13日获美国食品药品管理局(FDA)批准上市,商品名为Imbruvica,该药用于套细胞淋巴瘤(Mantle Cell Lymphoma, MCL)的治疗。


2. PhiKan083 泽布替尼(Zanubrutinib)

泽布替尼(zanubrutinib)是中国百济神州自主研发的抗癌药,2019年11月15日,美国FDA宣布“泽布替尼”以“突破性疗法”的身份,“优先审评”获准上市。2020年6月,泽布替尼获得中国NMPA批准上市,用于治疗既往至少接受过一种治疗的成人套细胞淋巴瘤(MCL)以及既往至少接受过一种治疗的成人慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。


BTK 临床前疾病模型


科途医学开发的BTK临床前疾病模型实验,包括:

  • 生化药理实验

  • 细胞药理实验

  • 药代动力学和药效动力学实验

  • 小鼠体内模型试验

这些BTK临床前疾病模型实验可作为BTK靶点药物研发及临床转化医学研究的工具,为新药研发企业及各大科研院所提供相关的研发技术服务。


BTK生化药理实验(BTK、ITK、Tec激酶检测)


在体外构建由纯化的激酶(BTK,ITK,Tec)、ATP、多肽底物、缓冲液体系构成的反应体系中,使用Promega公司ADP-Glo™ Kinase Assay试剂盒检测BTK抑制剂活性。BTK等蛋白和底物反应,消耗ATP,产生ADP,定量测定ADP水平,评价激酶活性及小分子化合物对激酶活性的抑制效果,计算药效剂量曲线和EC50。

不同BTK激酶抑制剂的活性检测数据.png

图2:不同BTK激酶抑制剂的活性检测数据


BTK细胞药理实验-测定化合物对血液癌细胞系的IC50


采用CellTiter-Glo®荧光素细胞存活率检测方法(Promega)测定药物对血液系统肿瘤细胞活力的抑制能力。在96孔板中接种一定浓度的细胞,保证检测时间内,细胞处于对数生长期,加入梯度稀释的化合物。经过数天的给药处理后,在细胞培养液中加入等体积的CellTiter-Glo®试剂,充分裂解细胞,在酶标仪上读取荧光信号。荧光信号值与细胞活力呈正相关,通过荧光信号值,计算药物抑制细胞活力的半抑制浓度。

Ibrutinib抑制Rec-1和TMD-8细胞活力检测数据.png

图3:Ibrutinib抑制Rec-1和TMD-8细胞活力检测数据


BTK抑制剂在抑制一组血液肿瘤细胞系活力的选择性筛选数据.png

图4:BTK抑制剂在抑制一组血液肿瘤细胞系活力的选择性筛选数据


可用于该评价的血液系统恶性肿瘤细胞系包括:

细胞系名称

说明

细胞系名称

说明
Rec-1人套细胞淋巴瘤细胞株,Mantle Cell Lymphoma, MCLDaudi人Burkitt淋巴瘤细胞株, Burkitt's Lymphoma
JEKO-1人套细胞淋巴瘤细胞株,Mantle Cell Lymphoma, MCLMOLT-4人急性淋巴母细胞白血病细胞株,Acute lymphoblastic leukemia, ALL
MINO人套细胞淋巴瘤细胞株,Mantle Cell Lymphoma, MCLJurkat人急性T细胞白血病细胞株,Acute T cell leukemia
MAVER-1人套细胞淋巴瘤细胞株,Mantle Cell Lymphoma, MCLCCRF-CEM人急性淋巴白血病细胞株,Acute lymphocytic leukemia , ALL
JVM-2人套细胞淋巴瘤细胞株,Mantle Cell Lymphoma, MCLRPMI-8226人多发性骨髓瘤细胞株, Multiple myeloma, MM
JVM-13人套细胞淋巴瘤细胞株,Mantle Cell Lymphoma, MCLU266人多发性骨髓瘤细胞株, Multiple myeloma, MM
Z-138人套细胞淋巴瘤细胞株,Mantle Cell Lymphoma, MCLMM-1人多发性骨髓瘤细胞株, Multiple myeloma, MM
TMD-8人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株,Diffuse Large B Cell Lymphoma,DLBCLKarpas-299人间变性大细胞淋巴瘤细胞株, Human Non-Hodgkin's Ki-positive Large Cell Lymphoma
Ramos人Burkitt淋巴瘤细胞株,Burkitt's LymphomaU937人组织细胞淋巴瘤细胞
Raji人Burkitt淋巴瘤细胞株,Burkitt's LymphomaHuT-78人T淋巴细胞白血病细胞
NAMALWA人Burkitt淋巴瘤细胞株,Burkitt's LymphomaMV4-11人慢性骨髓单核细胞性白血病
Kasumi-1人急性淋巴白血病细胞K562人慢性髓原白血病细胞
NCI-H929人骨髓瘤细胞HL-60人早幼粒急性白血病细胞
TF-1人红系白血病细胞HEL人红白细胞白血病细胞
THP-1人急性单核细胞白血病细胞My-La CD8+Human Caucasian T Lymphocyte, mycosis fungoides
SU-DHL-4人弥漫性组织细胞MEG-01人成巨核细胞白血病细胞
K-562人慢性髓原白血病细胞KU812人外周血嗜碱性白血病细胞
A3人T淋巴细胞白血病细胞C8166人T淋巴细胞白血病细胞
Reh人急性非B非T淋巴细胞白血病RAW264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞
KU812人外周血嗜碱性白血病细胞UT-7人类原巨核细胞型白血病细胞
























BTK细胞药理实验-细胞药效动力学实验  


B细胞受体(B cell receptor,BCR)交联激活后,BTK随后被募集到细胞膜,Tyr-551残基被Syk和Lyn激酶磷酸化。BTK在Tyr-223残基进行自磷酸化后被激活。BTK被激活后,磷酸化下游底物磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Cγ2(Phospholipase Cγ2,PLCγ2)。BTK抑制剂可抑制BTK自磷酸化,也可抑制PLCγ2的磷酸化。对于一些BTK不可逆抑制剂,抑制剂会共价键结合到BTK 蛋白481位的半胱氨酸,占据BTK蛋白的该激酶区域,导致探针无法结合到该区域,通过定量检测探针结合到该区域的能力可以进行BTK抑制剂的评价。


BTK蛋白结构示意图

   图5:BTK蛋白结构示意图


基于以上原理,可以在细胞水平上设计以下化合物抑制BTK激酶活性的检测实验:

  • 细胞BTKpY223激酶检测

  • 细胞BTK占据实验(BTK Occupancy Assay)

  • 细胞PLCγ2(pY783 Alpha LIS)激酶检测

  • 细胞ITK激酶检测

  • 细胞ITK占据实验(BTK Occupancy Assay)

  • 细胞ITK抑制对IL-2分泌影响检测

  • 细胞EGFR激酶检测

  • 细胞EGFR占据实验(EGFR Occupancy Assay)

  • 细胞水平EGFR抑制表型检测(Cell Viability Assay)


细胞BTK占据实验(BTK Occupancy Assay)  


该检测方法是基于BTK抑制剂一旦占据BTK激酶位点,就会形成与481位半胱氨酸的共价结合,阻断其它化合物的结合。在本检测方法中,待测化合物结合细胞内的BTK激酶位点后,通过探针测定没有被化合物占据的BTK蛋白的含量,可以计算待测化合物对细胞中BTK蛋白的结合能力。该方法也可以用于BTK抑制剂动物实验和人体临床试验的药效动力学研究。

细胞BTK占据实验原理示意图及Ibrutinib检测数据.png

图6:细胞BTK占据实验原理示意图及Ibrutinib检测数据

BTK小鼠体内模型  


小鼠皮下成瘤实验是用B细胞淋巴癌细胞系,Rec-1,TMD-8,Mino等在小鼠皮下接种,肿瘤开始生长后给药处理,定期观测肿瘤大小和体积,绘制体内肿瘤增值曲线和体重变化曲线。

小鼠异种移植REC-1套细胞淋巴瘤皮下模型中的药效实验.png

图7:小鼠异种移植REC-1套细胞淋巴瘤皮下模型中的药效实验


BTK耐药突变工程化改造细胞系及检测  

研究发现,Ibrutinib等共价不可逆抑制剂处理后,可能引发获得性耐药,其中T474( a gatekeeper residue,)位点和C481(共价结合氨基酸)位点的突变,会导致细胞对Ibrutinib产生耐药。开发下一代非共价结合BTK抑制剂,可能重新对这些位点突变的BTK产生抑制。

  • 293T-BTK-T474M细胞及检测

  • 293T-BTK-C481A细胞及检测

  • Rec-1-BTK-T474M细胞及检测

  • Rec-1-BTK-C481A细胞及检测

  • TMD-8-BTK-T474M细胞及检测

  • TMD-8-BTK-C481A细胞及检测

  • Jeko-1-BTK-T474M细胞及检测

  • Jeko-1-BTK-C481A细胞及检测

  • Mino-BTK-T474M细胞及检测

  • Mino-BTK-C481A细胞及检测

BTK shRNA knock-down细胞系及检测  

  • Mino-shRNA-NC-GFP

  • Mino-BTK-shRNA-9685-GFP

  • Mino-BTK-shRNA-9687-GFP


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